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黄曲霉素快速检测卡

　　由于黄曲霉素是一种致癌物质。

　　所以人们一定要小心的避开黄曲霉素这种细菌，如果不小心误食了黄曲霉素，积累过多一定会导致身体内的癌细胞病变，从而导致癌症。

　　有的食物里就含有黄曲霉素，所以一定要先了解食物所含的东西再吃。

　　接下来教大家黄曲霉素的测定方法。

　　检测方法

　　薄层分析法(TLC)

　　TLC法是检测黄曲霉素最为经典的方法，也是以前最为常用的方法，至今仍为一些检测机构所用，也是一种国标方法。

　　其原理是针对不同的试样，用适宜的萃取溶剂将黄曲霉素从试样中萃取出来，经柱层析净化后，再在薄板上展开后分离。

　　利用黄曲霉素的荧光特性，根据荧光斑点的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分很复杂的试样要双向展开，才能获得较高的灵敏度。

　　TLC法设备简单，检测费用低，但操作繁琐、费时，萃取和净化效果不理想，灵敏度差，对操作人员的身体健康存在较大程度的危害。

　　液相色谱法(HPLC)

　　HPLC法是近年来发展起来的一种检测方法。

　　其原理是在高效液相色谱仪上添加柱后衍生系统分离，再用荧光检测器测定。

　　与其配套的柱后衍生系统有碘衍生化法、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法。

　　当前，该方法大多用免疫亲和柱来净化、分离，其净化效果优异。

　　该法能准确地分离不同种类的黄曲霉素(例如：AFB1、AFB2、AFG1和AFM1等)，检测速度快且定性与定量准确，检测限低，可作为仲裁法使用，但仪器设备价格昂贵，前处理方法相对繁琐，若用到免疫亲和柱则会使试样检测费用增加，对操作人员的身体健康仍存在一定的危害。

　　酶联免疫法(ELISA)

　　ELISA法也是近年来研究开发出来的一种较为新颖的方法。

　　其原理是根据抗体和抗原之间特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度。

　　该方法检测速度快、对人体危害小、但重复性差、试剂寿命短、需低温保存、假阳性概率较高、需要配置专门的酶标仪，且对一些富含盐和脂肪的试样需进行额外的处理。

黄曲霉毒素试剂盒的各类试剂盒

　　 【检测原理】 试剂盒采用免疫竞争法分析原理结合胶体金标记技术进行检测。

　　【检测范围】 牛奶、生鲜奶等液态奶。

　　【技术指标】 测下限：0.5μg/kg；

　　【检测步骤】

　　样品处理：取1ml样品置于5ml离心管中，向离心管中加2ml提取剂，振摇2～3min后，用离心机以2000r/min,离心5min，取2ml上清液至另一个5ml离心管中，向其中加2ml净化剂，振摇5min，用离心机以2000r/min离心5min，吸取全部下层至点滴板的一个孔中自然挥干（或加热将其挥干），备用；

　　样品检测:向点滴板上滴加4滴缓冲液，使其充分溶解挥干后的残留物；取出检测卡，并做好标记，用袋中吸管吸取点滴板上的全部样液，滴加到检测卡的加样孔中（逐滴滴下），5～10min内观察结果；

　　结果判断：　阴性:测试线(T)与对照线(C)都出现，表明样品中黄曲霉毒素的浓度小于0.5μg/kg。

　　阳性:只有对照线(C),无测试线(T)，表明样品中黄曲霉毒素的浓度大于或等于0.5μg/kg。

　　无效:对照线(C)和测试线(T)都不出现，或者对照线（C）不出现。

　　【试剂盒装箱单】 名称 数量 单位 名称 数量 单位 提取剂 2 瓶 5ml离心管 20 个 净化剂 2 瓶 1ml一次性吸管 20 支 缓冲液 1 瓶 点滴板 1 个 检测卡 10 个 说明书 1 张 【检测原理】　本品采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，通过单克隆抗体竞争

　　结合 AFB1-BSA 偶联物和样品中可能含有的 AFB1 的原理。

　　试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的 AFB1-BSA 偶联物和被胶体金标记的抗 AFB1

　　单克隆抗体。

　　【检测范围】　粮食：花生、小麦、玉米、高粱等； 饲料：以小麦麸

　　皮、玉米面等粮食原料生产的饲料；食用油：玉米油，花生油及其他油脂；调味料（以粮食为主要原料）

　　【技术指标】　检测下限：5.0μg/kg；

　　【样品制备】

　　粮食：

　　任取 5g 以上有代表性样品并粉碎过 20 目筛，准确称取 2.0g 均匀粉碎试样于配套离心管中，再准确加入 4ml 纯净水和 4.0ml 乙酸乙酯，将瓶塞盖紧密封，充分振荡 5min，4000rpm 离心 1min 得上清液，将上清液用吸管移出 2.0ml 到蒸发皿或小玻璃杯中，用电吹风吹干上清液，再根据样品的种类按以下规定的稀释液量，用铝箔袋内配套吸管反复冲洗，彻底溶解杯底所有的固体，此溶解液为样品提取液即检测液。

　　饲料（以黄曲霉素B1检测残留限量 50ppb 计算）：任取 5g 以上有代表性样品并粉碎过 20 目筛，准确称取 2.0g 均匀粉碎试样于配套离心管中，再准确加入 4ml 纯净水和 4.0ml 乙酸乙酯，将瓶塞盖紧密封，充分振荡 5min，4000rpm 离心 1min 得上清液，将上清液用吸管移出 0.5ml 到蒸发皿或小玻璃杯中，用电吹风吹干上清液，再以 2ml 的稀释液量用铝箔袋内配套吸管反复冲洗，彻底溶解杯底所有的固体，此溶解液为样品提取液即检测液。

　　如果黄曲霉素B1检测残留限量是 30ppb，则用 1.2ml 的稀释液溶解；如果残留限量是 40ppb，则用 1.6ml 的稀释液溶解。

　　食用油：称 2.0g 油样于小烧杯中，用 8ml 正乙烷分次将试样转移至分液漏斗中，准确加入 4ml 纯净水充分振荡 3min，吸去上层正乙烷层，再加入4ml 的乙酸乙酯，将瓶塞盖紧密封，充分振荡 5min，静置或 3000rpm 离心得上清液，将上清液用吸管移出 2ml 到小玻璃杯中，用电吹风吹干，再用稀释液溶解后为样品提取液。

　　酱油、醋、发酵酒：称取 25.0g 样品于小烧杯中，用 5ml 蒸馏水将试样转移到分液漏斗中，加入 20ml 三氯甲烷，加塞轻轻振摇 3min，静置分层。

　　放出下层三氯甲烷层，经盛有约 5g 预先用三氯甲烷湿润的无水 Na2SO4 过滤器于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，用电吹风吹干。

　　吹干冷却后，准确加入稀释液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。

　　【检测步骤】

　　1. 在进行黄曲霉素B1检测前先完整阅读使用说明书，使用前将试纸卡和待检样本溶解恢复至室温；

　　2. 从原包装袋中取出试纸卡，打开后平放在桌面上，请在 1 小时内尽快使用；

　　3. 用吸管吸取待检样品溶液，滴加 3 滴于加样孔中，加样后开始计时；

　　4. 结果应在 10min 内读取，超过 12min 的时间判读无效。

　　【结果判断】

　　1. 阳性：位置 C 显示出红色线条，而位置 T 不显色时，或者位置 C 显示出红色线条，位置 T 显示颜色非常模糊时，判为阳性。

　　阳性结果表明：AFB1 含量超过样品允许量。

　　2. 阴性：位置 C 显示出红色线条，位置 T 同时显示出红色线条，且 T 线颜色接近 C 线或者深于 C 线时，判为阴性。

　　阴性结果表明：AFB1 含量低于样品允许量。

　　3. 无效：位置 C 不显示出红色线条，而位置 T 显示出红色线条，该试纸卡视为无效。

　　建议使用新的试纸卡按本说明书要求重新测试。

　　【注意事项】　　

　　1. 请按照操作步骤进行黄曲霉素B1检测，操作时请勿触摸试纸显示区。

　　2. 如购买时发现过期，破损，污染，无效的产品，请到购买处进行更换。

　　3. 黄曲霉素B1检测试纸卡为一次性产品，请勿重复使用。

　　4. 如遇稀释液不足，请用蒸馏水加入稀释液中混匀后使用。

　　5. 本品为筛选试剂，任何阳性结果请用其他方法做进一步确认。

　　6. 有条件的实验室可以用 AFB1 标准品测试后作为判断参考。

　　【自备清单】

　　感量 0.1g 的天平 、4000rpm 离心机、蒸发皿或烧杯、量筒、滴管、移液器具 、小型粉碎机 、乙酸乙酯、三氯甲烷、正乙烷、过滤器。

　　 【检测原理】

　　本试剂盒采用竞争ELISA原理，在微孔板上预包被黄曲霉毒素B1抗原（抗体），加入样本/黄曲霉毒素B1标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1抗体（抗原）。

　　样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1抗原（抗体）竞争黄曲霉毒素B1抗体（抗原）。

　　未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。

　　再加入TMB显色液，读取吸光值。

　　样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素B1的含量成负相关。

　　对照标准曲线，即可得出相应残留物黄曲霉毒素B1的含量。

　　【适用范围】

　　可定性、定量检测玉米、大米、麦类、豆类、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素B1。

　　（Ⅰ型及Ⅱ型试剂盒）可定性、定量检测婴儿配方食品，婴儿辅助食品等样本中的黄曲霉毒素B1。

　　（Ⅲ型试剂盒）

　　【试剂盒灵敏度】

　　Ⅰ型试剂盒灵敏度：0.1ppb；Ⅱ型试剂盒灵敏度：0.5ppb；Ⅲ型试剂盒灵敏度：10ppt（0.01ppb）

　　【交叉反应率】

　　结构类似物 交叉反应率

　　黄曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%

　　黄曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%

　　黄曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 11%

　　黄曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 4%

　　黄曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 0.5%

　　【试剂盒组成】

　　1. 96孔板×1块

　　2. 标准液×6瓶：（2ml/瓶）

　　3. 酶标物1瓶 ……………………………………………6ml

　　4. 显色液1瓶 ……………………………………………12ml

　　5. 终止液1瓶 ……………………………………………10ml

　　6. 浓缩洗涤液 （10×）1瓶……………………………50ml

　　7. 浓缩样品稀释液（10×）1瓶 ………………………50ml

　　【自备设备及试剂】

　　设备：

　　微孔板酶标仪450nm/630nm，振荡器，氮吹仪，粉碎机，离心机，天平：感量0.01g，微量移液器：单道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道移液器300μl

　　试剂：

　　甲醇（分析纯），石油醚，去离子水（或蒸馏水），三氯甲烷，NaCl

　　【试剂配制】

　　1. 样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩样品稀释液+9份去离子水）。

　　2. 洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水）。

　　3. 谷物稀释液：将0.9gNaCl用配制完成的样品稀释液溶解并定容至100ml。

　　4. 啤酒稀释液：取甲醇，用配制完成的样品稀释液按1:4体积比进行稀释（1份甲醇+4份样品稀释液）。

　　5. 50%甲醇：取甲醇，用去离子水按1:1体积比进行稀释（1份无水甲醇+1份去离子水）。

　　6. 80%甲醇：取甲醇，用去离子水按4:1体积比进行稀释（4份无水甲醇+1份去离子水）。

　　【样本前处理步骤】

　　按样品种类不同及检出限不同，需使用不同溶剂，以不同倍数稀释（具体见操作说明书）后震荡，离心后取100μl上清液待测。

　　【检测步骤】

　　一、 测定前须知：

　　1. 使用之前将所有试剂和所需板条回温（20～25℃）。

　　2. 使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置2～8℃，干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。

　　3. ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作中的要点。

　　4. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

　　二、操作步骤：（以Ⅰ型试剂盒为例，Ⅱ型及Ⅲ型试剂盒略有不同）

　　1. 将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。

　　2. 取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。

　　不可冷冻。

　　3. 洗涤工作液在使用前也需回温。

　　4. 将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

　　5. 加标准品/样本50μl到对应的微孔中，加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。

　　6. 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300μl/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

　　7. 加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。

　　8. 加终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。

　　【结果判定】

　　1. 百分吸光率的计算

　　标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

　　百分吸光率（%）= B/B0×100%

　　B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

　　B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值

　　2. 标准曲线的绘制与计算

　　以标准品百分吸光率为纵坐标，黄曲霉毒素B1标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。

　　将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际含量。

　　【注意事项】

　　1. 室温低于20℃或试剂及样本没有恢复到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

　　2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。

　　所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

　　3. 每种试剂使用前均需摇匀。

　　4. 反应终止液为0.5M硫酸，避免接触皮肤。

　　5. 不要使用过了有效期的试剂盒；也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

　　6. 储存条件：

　　试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，将不用的微孔板重新真空密封。

　　标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避光保存。

　　7. 试剂变质的迹象：

　　显色试剂有任何颜色表明显色剂变质，应当弃之。

　　0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

　　8. 加入显色液后，一般显色时间为15～30min。

　　若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。

　　反之，则减短反应时间。

　　9. 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

　　 【检测原理】

　　本试剂盒采用竞争ELISA原理，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本/黄曲霉毒素M1标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。

　　样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素M1与预包被在微孔板上的黄曲霉毒素抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。

　　未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。

　　再加入TMB显色液，读取吸光值。

　　样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素M1的含量成负相关。

　　对照标准曲线，即可得出相应残留物黄曲霉毒素M1的含量。

　　【适用范围】

　　可定性、定量检测牛奶，奶粉等样本中的黄曲霉毒素M1的含量。

　　【试剂盒灵敏度】

　　Ⅰ型试剂盒灵敏度：0.1ppb；Ⅱ型试剂盒灵敏度：0.02ppb；

　　【交叉反应率】

　　结构类似物 交叉反应率

　　黄曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 30%

　　黄曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 5%

　　黄曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 15%

　　黄曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 7%

　　黄曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 100%

　　【试剂盒组成】

　　1. 96孔板×1块

　　2. 标准液×6瓶：（2ml/瓶）

　　0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb（Ⅰ型试剂盒）

　　0ppt, 20ppt, 50ppt, 100ppt, 250ppt, 500ppt（Ⅱ型试剂盒）

　　3. 浓缩酶标记物 1瓶 …………………………………… 1ml

　　4. 酶标稀释液1瓶 ………………………………………… 7ml

　　5. 显色液1瓶 …………………………………………… 12ml

　　6. 终止液1瓶 …………………………………………… 10ml

　　7. 浓缩样本稀释液（20×）1瓶 …………………… 50ml（仅Ⅱ型试剂盒）

　　8. 浓缩洗涤液 （10×）1瓶 ………………………… 50ml

　　【自备设备及试剂】

　　设备：

　　微孔板酶标仪450nm/630nm，振荡器，离心机，天平：感量0.01g，微量移液器：单道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道移液器300μl

　　试剂：

　　去离子水（或蒸馏水）

　　【试剂配制】

　　1. 洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水）。

　　2. 酶标物的配制(现用现配，避光保存)：将浓缩酶标记物与酶标稀释液按1：19体积比进行稀释（1份酶浓缩液+19份酶标稀释液）

　　【样本前处理步骤】

　　一、 牛奶（稀释倍数：1）

　　1. 取待测样品，7000rpm室温下离心，5min；

　　2. 取下层100μl（或200μl）待测。

　　二、 奶粉（稀释倍数：5）

　　1. 取1.0g奶粉，加入5ml去离子水，混匀；

　　2. 7000rpm室温下离心，5min；

　　3. 取下层100μl（或200μl）待测。

　　【检测步骤】

　　一、测定前须知：

　　1. 使用之前将所有试剂和所需板条回温（20～25℃）。

　　2. 使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置2～8℃。

　　3. ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作中的要点。

　　4. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

　　二、操作步骤：（以Ⅰ型试剂盒为例，Ⅱ型试剂盒略有不同）

　　1. 将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。

　　2. 取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。

　　不可冷冻。

　　3. 洗涤工作液在使用前也需回温。

　　4. 将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

　　5. 加标准品/样本50μl到对应的微孔中，加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30min。

　　6. 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300μl/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

　　7. 加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30min。

　　8. 加终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。

　　【结果判定】

　　1. 百分吸光率的计算

　　标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

　　百分吸光率（%）= B/B0×100%

　　B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

　　B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值

　　2. 标准曲线的绘制与计算

　　以标准品百分吸光率为纵坐标，黄曲霉毒素M1标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。

　　将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素M1实际含量。

　　【注意事项】

　　1. 室温低于20℃或试剂及样本没有恢复到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

　　2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。

　　所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

　　3. 每种试剂使用前均需摇匀。

　　4. 反应终止液为0.5M硫酸，避免接触皮肤。

　　5. 不要使用过了有效期的试剂盒；也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

　　6. 储存条件：

　　试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，将不用的微孔板重新真空密封。

　　标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避光保存。

　　7. 试剂变质的迹象：

　　显色试剂有任何颜色表明显色剂变质，应当弃之。

　　0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

　　8. 加入显色液后，一般显色时间为15～30min。

　　若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。

　　反之，则减短反应时间。

　　9. 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

　　【样品最低检测限】

　　Ⅰ型试剂盒：

　　牛奶………………………………………………0.1ppb

　　奶粉………………………………………………0.5ppb

　　Ⅱ型试剂盒：

　　牛奶 ………………………………………………0.02ppb

　　奶粉 ……………………………………………… 0.1ppb

　　【贮藏条件及保存期】

　　贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。

　　保存期：该产品有效期为12个月。

　　 【检测原理】

　　本试剂盒采用竞争ELISA，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本/黄曲霉毒素总量标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素总量抗体。

　　样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素与预包被在微孔板上的黄曲霉毒素抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素总量抗体。

　　未结合的酶标抗体在洗涤时被除去，再加入TMB显色液，读取吸光值。

　　样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素总量的含量成负相关。

　　对照标准曲线，即可得出相应残留物黄曲霉毒素总量的含量。

　　【适用范围】

　　可定性、定量检测玉米、大米、麦类、豆类、花生、饲料、食用油等样本中的黄曲霉毒素总量。

　　【试剂盒灵敏度】

　　试剂盒灵敏度：0.1ppb

　　【交叉反应率】

　　结构类似物 交叉反应率

　　黄曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%

　　黄曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 75%

　　黄曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 100%

　　黄曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 97%

　　黄曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 30%

　　【试剂盒组成】

　　1. 96孔板×1块

　　2. 标准液×6瓶：（2ml/瓶）

　　0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

　　3. 酶标物1瓶 ………………………………………… 6ml

　　4. 显色液1瓶 ………………………………………… 12ml

　　5. 终止液1瓶 ………………………………………… 10ml

　　6. 浓缩洗涤液 （10×）1瓶………………………… 50ml

　　7. 浓缩样品稀释液（10×）1瓶 ……………………50ml

　　8. 浓缩样品稀释液（10×）1瓶 ……………………25ml

　　【自备设备及试剂】

　　设备：

　　微孔板酶标仪450nm/630nm，振荡器，氮吹仪，粉碎机，离心机，天平：感量0.01g，微量移液器：单道 20μl～200μl、200μl～1000μl、八道移液器300μl

　　试剂：

　　甲醇（分析纯），石油醚，去离子水（或蒸馏水），乙腈，NaCl

　　【试剂配制】

　　1. 样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩样品稀释液+9份去离子水）。

　　2. 洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水）。

　　3. 谷物稀释液：将0.9gNaCl用配制完成的样品稀释液溶解并定容至100ml。

　　4. 啤酒稀释液：取无水甲醇，用配制完成的样品稀释液按1:4体积比进行稀释（1份甲醇+4份样品稀释液）。

　　5. 50%甲醇：取无水甲醇，用去离子水按1:1体积比进行稀释（1份无水甲醇+1份去离子水）。

　　【样本前处理步骤】

　　按样品种类不同及检出限不同，需使用不同溶剂，以不同倍数稀释（具体见操作说明书）后震荡，离心后取100μl上清液待测。

　　【检测步骤】

　　一、测定前须知：

　　1. 使用之前将所有试剂和所需板条回温（20～25℃）。

　　2. 使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置2～8℃，干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。

　　3. ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作中的要点。

　　4. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

　　二、操作步骤：（以Ⅰ型试剂盒为例，Ⅱ型试剂盒略有不同）

　　1. 将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。

　　2. 取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。

　　不可冷冻。

　　3. 洗涤工作液在使用前也需回温。

　　4. 将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

　　5. 加标准品/样本50μl到对应的微孔中，加入酶标物50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。

　　6. 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300μl/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

　　7. 加入显色液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。

　　8. 加终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。

　　【结果判定】

　　1. 百分吸光率的计算

　　标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

　　百分吸光率（%）= B/B0×100%

　　B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

　　B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值

　　2. 标准曲线的绘制与计算

　　以标准品百分吸光率为纵坐标，黄曲霉毒素总量标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。

　　将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素总量实际量。

　　【注意事项】

　　1. 室温低于20℃或试剂及样本没有恢复到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

　　2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。

　　所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

　　3. 每种试剂使用前均需摇匀。

　　4. 反应终止液为0.5M硫酸，避免接触皮肤。

　　5. 不要使用过了有效期的试剂盒；也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

　　6. 储存条件：

　　试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，将不用的微孔板重新真空密封。

　　标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避光保存。

　　7. 试剂变质的迹象：

　　显色试剂有任何颜色表明显色剂变质，应当弃之。

　　0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

　　8. 加入显色液后，一般显色时间为15～30min。

　　若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。

　　反之，则减短反应时间。

　　9. 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

　　【样品最低检测限】

　　谷物 ………………………………………………0.8ppb

　　蛋糕 …………………………………………………1ppb

　　花生、奶油蛋糕……………………………………1ppb

　　食用油 ………………………………………………1ppb

　　饲料、面粉、汤圆………………………………2.4ppb

　　啤酒 ………………………………………………0.5ppb

　　酱油、醋 …………………………………………0.8ppb

　　【贮藏条件及保存期】

　　贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。

　　保存期：该产品有效期为12个月。